Pada tahun 1965 di Hawai, Kortschak, Hartt dan Burr menemukan bahwa daun tebu yang fotosintesisnya luar biasa cepat dan efisien, memfiksasi sebagian besar CO2 menjadi asam malat dan asam aspartat yang berkarbon-4.
Setelah kira-kira satu detik berfotosintesis, 80% C14 yang difiksasi terdapat dalam kedua asam tersebut, dan hanya 10% terdapat dalam PGA, yang menunjukkan bahwa dalam tanaman ini, PGA bukan merupakan hasil pertama fotosintesis. Hasil ini dipastikan oleh Hatch dan Slack di Australia, yang menemukan bahwa beberapa spesies Gramineae yang berasal dari tropika termasuk tanaman jagung, menunjukkan pola yang sama setelah memfiksasi C14O2. Tumbuhan yang menghasilkan asam berkarbon-4 sebagai hasil pertama fiksasi CO2 disebut tumbuhan C4 dan yang memfiksasi CO2 menjadi PGA disebut tumbuhan C3.
Reaksi yang mengubah CO2 menjadi asam malat dan asam aspartat adalah dengan berkombinasi dengan asam fosfoenolpiruvat (PEP) membentuk asam oksaloasetat dan Pi. Asam oksaloasetat bukan merupakan hasil fotosintesis yang selalu terdeteksi. Enzim yang mengkatalisis reaksi itu adalah fosfoenolpiruvat karboksilase (PEP karboksilase ) yang terdapat dalam sitosol.
Reaksi selanjutnya adalah mengubah asam oksaloasetat menjadi asam malat dan asam aspartat. Asam oksaloasetat dan NADPH2 dengan bantuan enzim malat dehidrogenase diubah menjadi asam malat dan NADP, reaksi ini berlangsung di kloroplas. Pembentukan asam aspartat dari asam oksaloasetat berlangsung dalam sitosol dan memerlukan satu asam amino lain seperti alanin sebagai sumber gugus amino. Tipe reaksinya adalah transaminasi karena melibatkan transfer satu gugus amino.
Dalam tumbuhan C4 terdapat pembagian kerja antara dua sel fotosintesis yang berbeda yaitu sel-sel mesofil dan sel-sel seludang parenkim. Sel-sel seludang parenkim hampir selalu mengelilingi ikatan pembuluh daun dan memisahkannya dari sel-sel mesofil. Asam malat dam asam aspartat dibentuk dalam sel-sel mesofil, dan PGA, sukrosa serta pati terutama dihasilkan dalam sel-sel seludang parenkim. RuBP karboksilase hanya terdapat dalam sel-sel seludang parenkim, demikian pula enzim-enzim daur Calvin, sehingga daur Calvin hanya berlangsung dalam sel-sel seludang parenkim.
Sebaliknya, PEP karboksilase terutama terdapat dalam sel-sel mesofil. CO2 yang masuk ke dalam sel-sel mesofil melewati stomata oleh enzim PEP karboksilase diubah menjadi asam malat dan asam aspartat, kedua asam ini dengan cepat dipindahkan ke dalam sel-sel seludang parenkim dan selanjutnya mengalami dekarboksilasi dengan melepaskan CO2. CO2 ini kemudian difiksasi oleh RuBP karboksilase diubah menjadi PGA untuk selanjutnya reaksinya mengikuti reaksi daur Calvin.
