(Artikel Metode Kultivasi Mikroba ini adalah bagian dari makalah dengan judul Kultivasi Mikroba. Bila anda memerlukannya sebagai bahan referensi, makalah Kultivasi Mikroba tersebut bisa anda DOWNLOAD DISINI)
Di habitat alaminya, mikroorganisme biasanya tumbuh dalam populasi yang kompleks dan terdiri dari beberapa spesies. Hal ini menyebabkan penelitian mengenai mikroorganisme dalam berbagai habitat menjadi sulit untuk dilakukan. Oleh karena itu, diperlukan suatu teknik untuk memisahkan populasi yang kompleks ini menjadi spesies yang berbeda-beda sebagai biakan murni. Biakan murni adalah suatu populasi sel yang ditumbuhkan dari satu sel induk.
Proses isolasi dan upaya mempertahankan keadaan murni memerlukan teknik aseptik . Oleh karena itu, sebelum mengkultur suatu mikroba harus dilakukan suatu proses sterilisasi.
2.4.1 Sterilisasi
Sterilisasi yang umum dilakukan dalam bidang mikrobiologi adalah :
a. Sterilisasi secara fisik
Sterilisasi secara fisik dilakukan dengan menggunakan uap air panas dan tekanan tinggi, misalnya dengan penggunaan autoklaf pada temperatur 121oC dan tekanan 1.5 atm selama 15 hingga 20 menit.
b. Sterilisasi secara kimia
Larutan kimia yang banyak digunakan dalam proses sterilisasi adalah larutan CuSO4, AgNO3, HgCl2, ZnO, dan alkohol ( kadar 50-75 % ) karena dapat menyebabkan koagulasi protein mikroba. Selain itu, basa kuat dan asam kuat juga dapat digunakan karena mampu menghidrolisis mikroba. Sterilisasi pada substrat dapat dilakukan dengan menggunakan larutan garam seperti NaCl (9%), KCl ( 11%), KNO3 (10%), KMnO4 (10%), dan HCl (1,1%). Khor dan senyawa khlor digunakan sebagai desinfektan, terutama pada tempat penyimpanan air. Larutan formaldehyde dengan kadar 4 – 20% juga dapat digunakan dalam sterilisasi secara kimia.
c. Sterilisasi secara mekanik
Sterilisasi secara mekanik dilakukan dengan menggunakan filter. Jenis filter yang digunakan tergantung dari tujuan penyaringan dan bahan yang akan disaring. Sterilisasi secara mekanik umumnya dilakukan pada bahan yang tidak tahan pada pemanasan ataupun tekanan yang tinggi.
2.4.2 Teknik Kultivasi Mikroba
Setelah semua bahan dan alat yang akan digunakan dalam proses kultivasi disterilkan, maka dimulailah proses isolasi untuk mendapatkan biakan murni.Bahan yang diinokulasikan pada medium disebut inokulum. Di bawah ini ada beberapa teknik inokulasi yang umum dilakukan di laboratorium mikrobiologi.
a. Teknik Penyebaran (The Spread-Plate Technique)
Teknik penyebaran yang lebih sering disebut dengan Spread-Plate adalah teknik langsung dan mudah untuk mendapatkan suatu biakan murni. Campuran dari beberapa spesies bakteri disebarkan di permukaan medium agar, sehingga setiap sel akan tumbuh menjadi koloni yang terpisah sempurna dan dapat dilihat secara makroskopis berupa kumpulan mikroba di atas medium padat. Setiap koloni yang terbentuk merupakan biakan murni. Di bawah ini adalah gambar dari biakan murni yang diperoleh dengan menggunakan teknik Spread-Plate. (gambar terdapat di makalah, silakan didownload)
b. Teknik Goresan (The Streak-Plate Technique)
Biakan murni juga dapat diperoleh dengan teknik goresan ( Streak-Plate Technique ). Inokulum digoreskan di atas medium dengan memakai ose menurut pola tertentu, yaitu :
1). Goresan T
Untuk membuat biakan murni dangan teknik goresan T, ada beberapa langkah yang harus diikuti, yaitu :
1.1 Lempengan dibagi menjadi 3 bagian dengan hutuf T pada bagian luar dasar cawan petri
1.2 Inokulasi daerah I sebanyak mungkin dengan gerakan sinambung.
1.3 Panaskan ose dan biarkan dingin kembali.
1.4 Gores ulang daerah I sebanyak 3-4 kali dan teruskan goresan di daerah II.
1.5 Pijarkan kembali ose dan biarkan dingin kembali.
1.6 Prosedur diatas diulang untuk daerah III
2). Goresan Kuadran
Teknik ini sama dengan goresan T, hanya lempengan agar dibagi menjadi 4, seperti yang terlihat pada gambar (gambar ada di makalah)
3). Goresan Radian
3.1 Goresan dimulai dari bagian pinggir lempengan.
3.2. Pijarkan ose dan dinginkan kembali.
3.2 Putar lempengan agar 90o dan buat goresan terputus dimulai dari bagian pinggir lempengan.
3.4 Putar lempengan agar 900 dan buat goresan terputus di atas goresan sebelumnya.
3.5 Pijarkan ose.
4). Goresan Sinambung
4.1 Ambil satu mata ose suspensi dan goreskan setengah permukaan lempengan agar.
4.2 Jangan pijarkan ose, putar lempengan 1800, gunakan sisi mata ose yang sama dan gores pada sisa permukaan lempengan agar. (Gambar di makalah)
Setelah inkubasi, sel-sel mikroba memperbanyak diri dan dalam waktu 18-24 jam akan terbentuk suatu massa sel yang disebut koloni. Koloni yang terbentuk ini adalah biakan murni.
c. Teknik lempeng tuang (Pour Plate Technique )
Teknik pour-plate (lempeng tuang) adalah suatu teknik di dalam menumbuhkan mikroorganisme di dalam media agar dengan cara mencampurkan media agar yang masih cair dengan stok kultur bakteri. Teknik ini biasa digunakan pada uji TPC (Total Plate Count). Kelebihan teknik ini adalah mikroorganisme yang tumbuh dapat tersebar merata pada media agar. Kultivasi mikroba dengan teknik ini dimulai dengan mengencerkan kultur bakteri yang telah ada dengan aquades. Selanjutnya, diaduk hingga rata dengan cara memutar tabung reaksi dengan telapak tangan selama beberapa kali. Larutan dilusi tadi sebanyak + 1 ml dituang ke dalam cawan petri. Cawan petri diputar secara perlahan-lahan di atas meja horizontal untuk mengaduk campuran media agar dengan dilusi kultur mikroba. Terakhir, inkubasi kultur ini pada kondisi yang sesuai. Tahapan di atas diilustrasikan pada gambar 5 di bawah ini (Gambar di makalah)
Biakan murni yang dihasilkan, jika disimpan dalam jangka waktu yang lama akan mudah sekali mengalami mutasi. Ini berarti, biakan murni yang disimpan terlalu lama bukan lagi biakan murni yang semula. Oleh karena itu, ada beberapa hal yang harus dilakukan untuk mencegah atau setidaknya mengurangi kemungkinan terjadinya mutasi, yaitu :
a). Secara periodik, biakan harus dipindahkan ke medium baru, sebaiknya pemindahan dilakukan pada fase log.
b). Biakan harus disimpan pada suhu rendah dan terhindar dari radiasi.
Mikroba diliofilisasikan, yaitu dimasukkan dalam ampul berisis susu kering bercampur CO2 kemudian disimpan pada tempat bersuhu rendah.
